Δευτέρα, 30 Νοεμβρίου 2009

Οπτικό μικροσκόπιο - Χρωστικές


ΧΡΗΣΗ του ΟΠΤΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ για την ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΙΣΤΩΝ και ΚΥΤΤΑΡΩΝ
Του Βιολόγου Περικλή Πιαλόγλου

(από το βιβλίο: Η πειραματική διδασκαλία των φυσικών επιστημών στην Ελλάδα - Πρόταση για ένα επιμορφωτικό πρόγραμμα - Εκδόσεις Γ. Πνευματικού Αθήνα 1993)


Το μικροσκόπιο αποτέλεσε το επιστημονικό όργανο πάνω στο οποίο στηρίχθηκε κατά μεγάλο μέρος η εξέλιξη της επιστήμης της Βιολογίας. Η εξέλιξη του αρχικού μοντέλου μικροσκοπίου του Antoni van Leeuwenhoek, το οποίο κατασκευάστηκε στα μέσα του 17ου αιώνα και δεν διέφερε πολύ από έναν απλό μεγεθυντικό φακό, έχει οδηγήσει στην κατασκευή των χρησιμοποιούμενων σήμερα οπτικών μικροσκοπίων.
Το σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο αποτελείται από δύο συγκλίνοντες φακούς, οι οποίοι βρίσκονται στον ίδιο οπτικό άξονα: τον αντικειμενικό, ο οποίος βρίσκεται κοντά στο παρατηρούμενο παρασκεύασμα και τον προσοφθάλμιο, ο οποίος βρίσκεται κοντά στο μάτι του παρατηρητή.
Οι αντικειμενικοί φακοί που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι οι 10x,25x, 40x, και 90x ή 100x. Οι αντικειμενικοί φακοί με μεγέθυνση 90x, 100x ονομάζονται καταδυτικοί.
Για τη χρήση τους απαιτείται η προσθήκη ειδικού ελαίου (με υψηλό δείκτη διάθλασης). Ο προσοφθάλμιος είναι κυρίως ο 10x.

Η αρχική μεγέθυνση οφείλεται στον αντικειμενικό φακό. Το παραγόμενο είδωλο μεγεθύνεται για δεύτερη φορά από τον προσοφθάλμιο φακό.
Η ολική μεγέθυνση στο σύνθετο μικροσκόπιο είναι ίση με το γινόμενο των επιμέρους μεγεθύνσεων των δυο φακών.

Η ικανότητα διάκρισης δύο σημείων που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση στο παρατηρούμενο παρασκεύασμα ονομάζεται διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου.
Για τη μεγέθυνση 900x, η διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου είναι 0,27μm.
Το βάθος πεδίου μειώνεται, όσο αυξάνεται η μεγέθυνση:
Από 7μm στη μεγέθυνση 100x.
Στα 0,5 μm στη μεγέθυνση 900x.
Η επιλογή της κατάλληλης μεγέθυνσης στο μικροσκόπιο εξαρτάται από το προς παρατήρηση αντικείμενο.
Η δυνατότητα διάκρισης των διαφόρων τμημάτων του κυττάρου οφείλεται στο γεγονός ότι τα διάφορα συστατικά του κυττάρου απορροφούν ή διαθλούν το φως σε διαφορετικό βαθμό.
Έτσι, για παράδειγμα, οι μεμβράνες του κυττάρου εμφανίζουν σκούρο χρώμα σε αντίθεση με το σχεδόν διαφανές κυτταρόπλασμα.
Στους φυτικούς ιστούς, η παρατήρηση υποβοηθείται από την παρουσία πολλών χρωστικών, όπως η χλωροφύλλη στα πράσινα μέρη του φυτού.
Σε πολλές περιπτώσεις, όμως, οι υπάρχουσες χρωματικές αντιθέσεις (contrast) δεν είναι οι κατάλληλες για την παρατήρηση των λεπτομερειών σε ένα κύτταρο.
Η αύξηση της αντίθεσης στο παρατηρούμενο παρασκεύασμα επιτυγχάνεται είτε με την χρήση διαφορετικών τύπων μικροσκοπίας, π.χ. με μικροσκοπία αντιθέτων φάσεων (οι οποίες απαιτούν ειδικό επιπλέον εξοπλισμό στο μικροσκόπιο), είτε με την χρήση ειδικών χρωστικών.
Οι χρωστικές χρησιμοποιούνται για να βελτιωθεί η εικόνα του παρασκευάσματος στο οπτικό μικροσκόπιο. Είναι κατά κύριο λόγο, οργανικές ενώσεις, οι οποίες συνδέονται εκλεκτικά με τα διάφορα συστατικά ή οργανίδια του κυττάρου.
Οι θετικά φορτισμένες χρωστικές (κατιονικές), όπως το κυανούν του μεθυλενίου (Methylele blue), η σαφρίνη και το Crystal violet, συνδέονται με τα αρνητικά φορτισμένα συστατικά του κυττάρου (π.χ. με τα νουκλεϊνικά οξέα ή τους όξινους πολυσακχαρίτες. Επειδή οι επιφάνειες των κυττάρων είναι αρνητικά φορτισμένες, οι χρωστικές της κατηγορίας αυτής μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν γενικής χρήσης χρωστικές. Οι αρνητικά φορτισμένες χρωστικές (ανιονικές), όπως η όξινη φουξίνη και το ερυθρό του Κονγκό (Congo red) συνδέονται με τα θετικά φορτισμένα συστατικά του κυττάρου, όπως τις πρωτεϊνες.
Συνδυασμός περισσότερων της μιας χρωστικών μπορεί να δώσει χρωματικά αποτελέσματα ανάλογα με το είδος του κυττάρου (διαφορική χρώση).
Η πλέον χρησιμοποιούμενη διαφορική χρώση είναι η χρώση Gram, η οποία χρησιμοποιείται για τη διάκριση των βακτηρίων σε Gram θετικά και Gram αρνητικά.
Χρώση Gram: Τα βακτήρια τα οποία έχουν προηγουμένως μονιμοποιηθεί με θέρμανση σε αντικειμενοφόρο πλάκα, χρωματίζονται αρχικά με crystal violet
(1 min) ακολουθεί πλύση με απεσταγμένο νερό και χρώση με Lugol (3 min).
Ακολουθεί αποχρωματισμός με αλκοόλη (30 sec) και χρώση με σαφαρίνη
(2 min).
Τα Gram θετικά βακτήρια εμφανίζουν μπλε χρώμα και τα Gram αρνητικά βακτήρια κόκκινο.
Τέλος, με τη χρήση κατάλληλων ιστών και τεχνικών είναι δυνατή η παρατήρηση με το οπτικό μικροσκόπιο δαφόρων λειτουργιών του κυττάρου, όπως η μιτωτική και η μειωτική διαίρεση.

1 σχόλιο:

ΜιλτοΣ είπε...

Ο Ολλανδός Leeuwenhoek (1632-1723) με απλά, δικής του κατασκευής μικροσκόπια (ήταν σπουδαίος τεχνίτης στην κατασκευή φακών) κάνει ανακαλύψεις που θεωρούνται θαυμαστές για την εποχή του. Παρατηρεί στο αίμα του για πρώτη φορά τα ερυθρά αιμοσφαίρια και στο νερό μικροσκοπικά όντα, τα μικρόβια.
Ο Χουκ σε τομές με πολύ μικρό πάχος, φελλού, είδε σειρές κολλημένων κουτιών, των κυττάρων όπως τα ονόμασε. Σ' αυτές τις τομές φαίνονταν μόνο οι πλευρές (τα τοιχώματα) των κυττάρων που είναι παχιές και ευδιάκριτες από τις εναποθέσεις διαφόρων ουσιών φελλού, ξύλου κ.ά. Γι' αυτό γρήγορα φάνηκε πως όλα τα μέρη των φυτών αποτελούνται από κύτταρα. Στα ζώα όμως, τα περισσότερα κύτταρα δεν παρουσιάζουν εναποθέσεις, δεν είναι ευδιάκριτα κι έτσι για πολύ καιρό αμφισβητήθηκε πως τα ζώα αποτελούνται από κύτταρα.
Δυο γερμανοί, ο ζωλόγος Σβάνν (1810-1882) και ο βοτανολόγος Σλάϊντεν (1804-1881) πρότειναν το 1839 μια νέα ερμηνεία και νέα αρχή.
Το σημαντικό δεν είναι τα τοιχώματα του κουτιού μα το περιεχόμενό του. Το περιεχόμενο του είναι το ζωντανό κύτταρο και τα ζώα αποτελούνται κι αυτά από κύτταρα. Κάθε ζωντανός οργανισμός είναι μια συνάθροιση κυττάρων (οτιδήποτε δεν είναι κύτταρο προέρχεται από εκκρίσεις κυττάρων)